Quesos artesanales venezolanos: evaluacion de la calidad bacteriologica e identificacion de bacterias acido lacticas como componentes bacterianos de interes biotecnologico.
Venezuelan Artisanal cheeses: Assesment of bacteriological quality and identification of lactic acid bacteria as bacterial components of biotechonological interestINTRODUCCION
La designacion de queso artesanal se refiere a quesos elaborados a mano utilizando procedimientos pocos o no mecanizados, segun usos y costumbres tradicionales que conservan maestros queseros calificados. A diferencia de aquellos elaborados industrialmente que usan leche pasteurizada, los quesos artesanales se preparan con leche cruda como materia prima. Como resultado, estos quesos son a menudo mas complejos en sabor y variedad. Las diferencias sensoriales caracteristicas de los quesos elaborados con leche cruda estan relacionadas, entre otros factores, con las dinamicas microbianas particulares de cada uno. Las bacterias acido lacticas como Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus fermentum son componentes esenciales para la produccion de una amplia variedad de quesos italianos (Parmesano, pecorino, mozzarella, entre otros) [5]. El predominio de especies bacterianas en este producto resulta de una combinacion de factores como son: 1) Las caracteristicas propias de la leche cruda, relacionadas con la raza y nutricion del ganado que la produce, 2) la microbiota natural de las leches regionales y 3) los procedimientos empleados en su tratamiento [2,4]. Caracterizar la dinamica poblacional bacteriana de los quesos artesanales es un problema muy interesante desde el punto de vista teorico y tecnologico.
En Venezuela se han desarrollado diferentes tipos de quesos blancos artesanales: llanero, guayanes, de mano, telita, crineja o trenza, palmita, Santa Barbara, criollo fresco y madurado. Es comun en la elaboracion artesanal e industrial de quesos el empleo de una mezcla comercial de enzimas cuyo principal componente es quimosina, tambien llamada "cuajo". Dependiendo de la variedad, su contenido de sal puede ser moderado o alto, y sus texturas, suave, semi-dura y dura. Segun datos de la Encuesta de Seguimiento al Consumo de Alimentos del Instituto Nacional de Estadistica [7], la leche y el queso blanco son los lacteos mas consumidos por la poblacion venezolana. La caracterizacion de estos quesos constituye un paso inicial para extender su produccion a mayor escala. Existe un reporte del aislamiento, identificacion y caracterizacion de la flora lactica presente en el queso artesanal ahumado andino, en el cual se demuestra la presencia principalmente de bacterias acido lacticas de los generos Lactobacillus y Lactococcus [1]. En otro estudio, Rodriguez y col. [13], aislaron e identificaron bacterias del genero Enterococcus a partir de queso ahumado andino, y evaluaron su potencial biotecnologico incluyendo este aislado en diferentes mezclas junto a Lactobacillus y Lactococcus como cultivos iniciadores, para la produccion de un queso con las caracteristicas sensoriales del producto artesanal, pero que la materia prima sea leche pasteurizada [13]. A pesar que el uso de leche cruda como materia prima conlleva un riesgo de contaminacion por bacterias patogenas, en Venezuela no existen registros formales de brotes infecciosos asociados al consumo de quesos artesanales nacionales, aunque si se haya reportado la deteccion de los |patogenos Staphylococcus aureus y Escherichia coli O157:H7 en muestras de queso artesanal de cuatro Estados venezolanos [11].
Una manera rapida y eficaz de realizar la deteccion, identificacion taxonomica y caracterizacion bacteriologica en los alimentos es la aplicacion de metodos de biologia molecular como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), dada su alta sensibilidad y especificidad. Esta herramienta analitica que permite indagar la composicion bacteriana de los quesos, los componentes biotecnologicos derivados de su produccion artesanal, y la deteccion temprana de patogenos.
El objetivo de esta investigacion fue detectar por PCR simple, la presencia de las bacterias acido lacticas Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus fermentum, asi como descartar, a traves de PCR multiple, los patogenos Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogenes y E. coli en muestras de quesos artesanales venezolanos.
MATERIALES Y METODOS
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Se emplearon cinco cepas de referencia como controles positivos para verificar la amplificacion especifica con los oligonucleotidos utilizados en este estudio. Las cepas de referencia Streptococcus thermophillus (Centro Venezolano de Colecciones Microbianas CVCM 0649) y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (CVCM 1393), fueron crecidas en medio liquido MRS (DIFCO) y en MRS agar (DIFCO), a 37[grados]C en condiciones de microaerofilia. Las cepas de referencia Salmonella enterica subsp. enteritidis (Instituto Nacional de Nutricion-INN), Shigella flexneri (INN). Escherichia coli 0157:H7 (CVCM 0417) se cultivaron en medio LB liquido y solido y Listeria monocytogenes (CVCM 446) en medio PALCAM (OXOID[R]). La presencia de L. fermentum se confirmo por la secuenciacion de los productos de PCR obtenidos de cuatro muestras seleccionadas al azar en la Unidad de Estudios Geneticos y Forenses del Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas ya que no se contaba con la cepa de referencia.
Analisis bacteriologico
En total, se recolectaron siete muestras de cuajada (C) y siete muestras de diferentes tipos de queso fresco (Q) provenientes de casas de familia, fincas y pequenas empresas de produccion artesanal. Diez en el municipio Miranda (C01, Q01, C02, Q02, C03, Q03, C04, Q04, C05 Y Q05) (Edo. Guarico), dos en el municipio Alberto Adriani (C06, Q06) (Edo. Merida) y dos en el municipio Colon (C07, Q07) (Edo. Zulia). Los quesos fueron producidos utilizando como materia prima leche vacuna cruda (Guarico) y mezclas de leche cruda vacuna y bufalina (Merida y Zulia), tratadas con cuajo comercial (Giber de Venezuela, C. A. [R]). Las muestras de queso y cuajada escurrida se trasladaron al laboratorio en bolsas con cierre hermetico a temperatura de refrigeracion 4-8[grados]C, en cavas con hielo. Ademas, en cada una de las tres localidades se tomaron por triplicado muestras de suero drenado de la cuajada, tres (Sur del Lago) y tres (Mpio. Miranda-Edo. Guarico) usado para lavar el queso una vez prensado, y tres muestras de leche que seria destinada a la produccion de queso: dos de ellas en el municipio Miranda-Edo. Guarico y una en el Sur del Lago-Edo. Merida; todas las muestras obtenidas por sumergir el hisopo en suero o en leche se trasladaron embebidas en los medios de transporte Cary-Blair (OXOID[R]) y tiogliocolato (CONDA[R]) estas se mantuvieron a temperatura ambiente, por un tiempo maximo de una semana, para analisis bacteriologico posterior. Estos medios de transporte permiten la preservacion de las muestras hasta por 45 dias.
El analisis bacteriologico para la identificacion de Salmonella y Shigella se llevo a cabo en un total de nueve muestras: tres de leche (Municipio Miranda-Edo.Guarico) y seis muestras de suero drenado (de tres fincas del Sur del Lago y tres muestras de dos fincas del municipio Miranda-Edo. Guarico, de una de las fincas se obtuvo suero drenado sin sal y tambien suero salado).
Las muestras de leche y suero se analizaron para deteccion de Salmonella spp. y L. monocytogenes mediante la aplicacion de los protocolos descritos en las normas COVENIN 1291:1988 [10] y COVENIN 3718:2001 [9]. Adicionalmente, las colonias consideradas presuntivas fueron crecidas en caldo para identificacion molecular posterior.
Aislamiento de ADN y reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)
Las muestras de cuajada o queso (2 g) se homogeneizaron en una inyectadora esteril en 5-8 mL de buffer fosfato salino. Se tomo 1 mL de este homogenato y se aislo el ADN total empleando el metodo litico, cuya eficiencia fue analizada en un estudio comparativo realizado por Quigley y col. [12]. El sedimento de las bacterias obtenidas de colonias presuntivas crecidas en caldo fue empleado para aislar ADN mediante el metodo fisico de ebullicion. Para la identificacion de las bacterias acido lacticas L. fermentum; L. delbrueckii subsp. bulgaricus y para S. thermophilus se emplearon oligonucleotidos especie-especificos [5] (TABLA I). Por otra parte, se procedio a detectar bacterias Salmonella spp. y Shigella spp., utilizando oligonucleotidos genero-especifico de acuerdo a He y col. [8], y en el caso de cepa E. coli O157:H7 y L. monocytogenes la deteccion se realizo con los oligonucleotidos especie-especificos, reportados por Yang y col. [14]. TABLA I. Se procedio al analisis por PCR multiple, del ADN total extraido de 1) muestras de queso y 2) muestras de cuajada escurrida antes del salado. Todas las PCR se realizaron por triplicado. Los resultados de analisis de PCR multiple para los patogenos Salmonella spp., Shigella spp. y E. coli O157:H7 tambien se confirmaron independientemente por PCR simple. La reaccion de PCR estaba compuesta por: Buffer 5X, Mg[Cl.sub.2] 1,5 mM, ADN total (50-150 ng), dNTPs 200 pM, oligonucleotidos 0,4 [micro]M, 1U de Flexi GoTaq ADN polimerasa (PROMEGA). Todos los ensayos se realizaron en un volumen de reaccion total de 25 uL. Las condiciones de los ensayos de PCR fueron: 1) Para la deteccion de Salmonella spp., Shigella spp. y E. coli O157:H7: 95[grados]C (5 min), seguido de 35 ciclos: 95[grados]C (30 seg), 58[grados]C (45 seg), 72[grados]C (1 min), 2) Para la deteccion de S. thermophilus, L. fermentum y L. delbrueckiii subsp. bulgaricus :95[grados]C (5 min), seguido de 35 ciclos: 95[grados]C (30 seg), 58[grados]C (45 seg) 68[grados]C (1 min), y 3) Para L. monocytogenes 95[grados]C por 10 min seguido de 40 ciclos: 94[grados]C (30 seg), 50[grados]C (30 seg) 72[grados]C (1 min) y finalmente un paso de extension de 72[grados]C (10 min).
RESULTADOS Y DISCUSION
Se observo que en dos muestras de Ancas distintas, ambas del municipio Miranda, una de leche y otra de suero drenado, se aislaron colonias presuntivas para Salmonella spp. La presencia de este genero bacteriano en las muestras de leche y suero tambien se detecto por PCR.
Tambien a partir de dos muestras de suero drenado (una muestra del municipio Miranda-Edo Guarico y una muestra del municipio Alberto Adriani-Sur del Lago) se aislaron colonias presuntivas de L. monocytogenes, sin embargo, el analisis realizado por PCR no arrojo un resultado confirmatorio de la presencia de este patogeno en ninguna de estas (resultados no mostrados).
En la totalidad de las muestras de cuajada y queso procesadas, el resultado negativo del analisis de PCR permitio descartar la presencia de Salmonella, Shigella y E.coli O157:H7. Se conoce que bacterias del genero Lactobacillus, en particular cepas de las especies L. fermentum, L. gallinarum, L. rhamnosus y L. plantarum aisladas de productos lacteos, han demostrado potente actividad inhibitoria contra patogenos causantes de enfermedades entericas (E. coli y Salmonella spp.) [2]. En el presente trabajo, en todas las muestras analizadas de queso y cuajada se identificaron bacterias acido lacticas (TABLA II) S. thermophilus, L. fermentum (FIG.1) y L. delbrueckii subsp. bulgaricus (FIG. 2). Considerando que existen evidencias que demuestran que S. thermophilus produce una bacteriocina termolabil que exhibe actividad bacteriostatica contra patogenos como Listeria monocytogenes y algunas especies de Bacillus [6], es posible postular que el predominio de bacterias acido lacticas (Streptococcus, Lactobacillus, entre otros generos) en este producto artesanal sea un factor determinante en la prevencion de la proliferacion de enteropatogenos.
CONCLUSIONES E IMPLICACIONES
El presente estudio establece la presencia de algunas especies de bacterias acido lacticas de interes biotecnologico en quesos artesanales venezolanos. Ademas corrobora la especificidad de metodos moleculares para la deteccion tanto de bacterias acido lacticas asi como bacterias patogenas en alimentos.
Es posible sugerir el uso industrial de las bacterias acido lacticas identificadas en este estudio para anadir cualidades sensoriales a quesos elaborados a mayor escala. Se recomienda ampliar este tipo de estudios a otros ambitos de America Latina e integrar sinergicamente resultados a nivel de toda la region para el establecimiento de estrategias de mejoramiento de la calidad de productos lacteos, que puedan ser difundidas adecuadamente a corto y mediano plazo entre sus productores.
AGRADECIMIENTO
Al Fondo Nacional de Ciencia, Tecnologia e Innovacion (FONACIT) como ente financiador del Proyecto PEII No 2012000816 titulado: <<Caracterizacion Microbiologica de Leche y Productos Lacteos en los Estados Zulia y Guarico>>, al Instituto Nacional de Nutricion y a la Universidad Nacional Experimental Sur del Lago "Jesus Maria Semprun" por el apoyo en la recoleccion y procesamiento de muestras.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Recibido: 26/10/2015 Aceptado: 01/03/2016
Estalina Baez-Ramirez (1) *, Junior Medina (1), Arnelly Escalona (3), Jesus Rodriguez (4), Andrea Olivares (4) y Luz Thomas (1)
(1) Centro de Biofisica y Bioquimica, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas (IVIC). Apartado Postal 20632, Caracas 1020-A, Venezuela. (3) Instituto de Prevision Social IPASME. Caracas-Venezuela. (4) Escuela de Bioanalisis, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. * Correspondencia: [email protected]
Leyenda: FIGURA 1 CORRIDA ELECTROFORETICA DE PRODUCTOS DE PCR Arriba : S. thermophilus y Abajo : L. fermentum. 1 100 pb ladder (Gene Aid), 2 C01, 3 Q01; 4 C02, 5 Q02; 6 C03, 7 Q03; 8 C04, 9 Q04; 10 C05, 11 Q05; 12 C06, 13 Q06; 14 C07, 15 Q07;16 CONTROL NEGATIVO, y 17 CONTROL POSITIVO S. thermophilus. C=CUAJADA y Q=QUESO. S.thermophilus 577 pb y L.fermentum 310 pb. Agarosa 1,5%. Tincion Diamond (PROMEGA)
Leyenda: FIGURA 2. CORRIDA ELECTROFORETICA DE PRODUCTOS DE PCR L. delbrueckii subsp. bulgaricus. 1 100 pb ladder (INVITROGEN), 2 C01, 3 Q01; 4 C02, 5 Q02; 6 C03, 7 Q03; 8 C04, 9 Q04; 10 C05, 11 Q05; 12 C06, 13 Q06; 14 C07, 15 Q07;16 y 17 vacios; 18 CONTROL NEGATIVO, 19 CONTROL POSITIVO. C=CUAJADA y Q=QUESO. Agarosa 1,5%. Tincion Diamond (PROMEGA)
TABLA I
OLIGONUCLEOTIDOS USADOS EN ESTE ESTUDIO
Especies
bacterianas Secuencia 5'-3' Gen
Streptococcus F: GCTTGTGTTCTGAGGGAAGC lacZ
thermophilus R:CTTTCTTCTGCACCGTATCCA
Lactobacillus F:GGAAGACTCCGTTTTGGTCA lacZ
delbrueckii subsp. R:AGTTCAAGTCTGCCCCATTG
bulgaricus
Lactobacillus F: CCAGATCAGCCAACTTCACA Arginine-
fermentum R: GGCAAACTTCAAGAGGACCA Ornitine
antiporter
Salmonella spp. F:ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG hisJ
R:ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA
Shigella spp F:TGTATCACAGATATGGCATGC ipaH
R:TCCGGAGATTGTTCCATGTG
E. coliO157:H7 F:TTTATACGGACATCCATGTGA rfbE
R: TTAATTCCACGCCAACCA
L. monocytogenes F:5'-TGAATGCAATTTCGAGCCTA-3' hly
R:5'-CGCCGAAGTTTACATTCAAGC-3'
Tamano
Especies esperado
bacterianas (pb)
Streptococcus 577 pb
thermophilus
Lactobacillus 395 pb
delbrueckii subsp.
bulgaricus
Lactobacillus 310 pb
fermentum
Salmonella spp. 495
Shigella spp 242
E. coliO157:H7 627
L. monocytogenes 360
TABLA II
CUADRO RESUMEN DE RESULTADOS DE IDENTIFICACION DE BACTERIAS ACIDO
LACTICAS POR
Especie
L. delbrueckii
subsp.
Producto # L. fermentum bulgaricus S. thermophilus
Cuajada (C) C01 + + +
C02 + + +
C03 + + +
C04 + + +
C05 + + +
C06 + + +
C07 + + +
Queso (Q) Q01 + + +
Q02 + + +
Q03 + + +
Q04 + + +
Q05 + + +
Q06 + + +
Q07 + + +
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| Author: | Baez-Ramirez, Estalina; Medina, Junior; Escalona, Arnelly; Rodriguez, Jesus; Olivares, Andrea; Thoma |
|---|---|
| Publication: | Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias |
| Article Type: | Ensayo |
| Date: | Mar 1, 2016 |
| Words: | 2991 |
| Previous Article: | Editorial. |
| Next Article: | Evaluacion fisicoquimica, sensorial y vida util de galletas enriquecidas con subproductos proteicos de suero de queseria. |
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